汝 昆

主任醫師，研究員。擅長血液病理的疑難病例診斷，目前致力于人工智能在血液病的精準診斷方面的研究。承擔國家級和省市級課題及人才項目11項；國內外期刊發表學術論文100余篇；參編7部血液學專著；主導和參與制定11項血液病診療中國專家共識/指南；中國認可委醫學專委會委員、國家藥監局醫療器械分類技術委員會委員、中國生物醫學工程協會人工智能分會血液病輔助決策標準化學組組長、人工智能醫療器械標準化技術歸口單位專家組專家、中國老年醫學會病理學分會副會長、中國抗癌協會血液腫瘤專委會常委兼血液病理工作組組長、天津市醫學會病理學分會主任委員、天津醫師協會檢驗醫師分會副會長等；擔任美國臨床病理雜志、北美醫學雜志、中華病理學雜志、中華血液學雜志、臨床與實驗病理學雜志、白血病淋巴瘤等雜志編委。

二代測序（Next-generation sequencing，NGS）技術從誕生到現在，雖然只有短短十幾年的時間，但是其應用范圍已經深入到了從基礎科研到臨床的各個領域。然而在具體實踐中，由于缺乏統一的行業標準，在檢測基因設計、實驗操作、基因突變描述、生物信息分析、結果解讀等方面依然存在不規范。中國抗癌協會血液腫瘤專業委員會、中華醫學會血液學分會、中華醫學會病理學分會組織制定的《二代測序技術在血液腫瘤中的應用中國專家共識（2018年版）》[1]（以下簡稱《共識》），從NGS應用最為成熟的基因突變檢測角度出發，圍繞“為什么做”、“怎么做”及“如何做好”三個方面，對NGS在血液腫瘤中的應用給出了指導性的意見。

一

為什么血液腫瘤患者需要進行NGS檢測？

任何一項新的生物技術之所以能夠在臨床快速發展，都和臨床需求緊密相關。隨著血液腫瘤發病機制研究的不斷深入，基因突變在疾病發生發展過程中的作用逐漸被證實，其中具有明確臨床意義的突變基因已經被納入了國際分類或診療指南中[2,3]。而NGS憑借高通量、高靈敏度、可定量和成本低的優勢，在基因突變檢測方面有著不可替代的作用。因此，正如《共識》所提及，NGS在血液腫瘤的診斷分型、預后判定、治療指導、微小殘留病（MRD）監測和克隆演變方面都具有重要的應用價值。

1.血液腫瘤診斷分型：從最新WHO分類中新增的以基因突變命名的亞型可以看出，基因突變檢測已經成為血液腫瘤診斷的必要手段。急性髓系白血病伴重現性遺傳學異常、遺傳易感性髓系腫瘤、骨髓增殖性腫瘤、骨髓增生異常綜合征伴環形鐵粒幼細胞、毛細胞白血病和淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥中存在一些特異性的突變基因，這些突變基因的檢測是其診斷的主要標準之一。在其它血液腫瘤的診斷中，突變基因的檢測同樣可以起到輔助診斷的作用[1]。

2.預后判定：隨著基因組學研究的深入，越來越多的突變基因被納入到血液腫瘤的預后分層體系。而且大多數血液腫瘤患者往往會同時發生多種基因突變，單一基因突變的檢測已不足以精準地指導臨床預后，多種基因突變的聯合分析已成為近年的研究熱點，所以NGS的高通量特點優勢顯著。

3.治療指導：血液腫瘤是一類異質性很強的腫瘤，對患者遺傳背景的全面分析是實現個體化治療的前提。通過突變基因的檢測，可以選擇相應的靶向藥物，同時對傳統藥物的敏感性進行評估。

4.微小殘留病（MRD）監測：血液腫瘤MRD監測的分子指標主要包括融合基因、異常表達基因及基因突變。目前，流式細胞學（FCM）和RQ-PCR依然是MRD主流的監測方法，RQ-PCR靈敏度較FCM高，可達10-5，但每次反應僅能檢測一個基因片段，適用于明確的分子異常，主要作為融合基因、常見類型比如NPM1突變以及WT1表達等指標的MRD監測手段。相比之下，NGS能夠同時檢測多個突變基因、突變位點及突變類型，對復發時不具有先前的突變或出現新突變的患者，NGS多靶點意義尤為突出，而且NGS通過提高檢測深度可進一步提高靈敏度。

5.克隆演變：基因突變是腫瘤細胞克隆演變的基礎和前提，在克隆演變的過程中，血液腫瘤會發生基因突變負荷的改變、新突變基因的出現或者原有突變基因的丟失，這種復雜的基因改變是傳統的PCR或Sanger測序無法檢測到的，而NGS可一次檢測到所有的基因變異，有效識別亞克隆。通過NGS分析克隆演變，有助于了解血液腫瘤的分子發病機制、耐藥機制，預測疾病的發展，并為治療提供新的靶點[4-7]。

二

怎么做NGS？

《共識》對NGS檢測的基因列表設計、整體實驗流程、生物信息分析及最終的報告規范和解讀進行了完整的介紹。

1.如何設計基因檢測列表？首先，應充分考慮基因列表的臨床適用性。由于實驗室檢測最終要服務于臨床診療，因此設計基因列表要從臨床診療的實際需求出發，由血液和實驗室專家共同制定；其次，檢測基因的篩選應考慮臨床意義的重要性；檢測基因的數量應在滿足臨床需求的基礎上，綜合樣本數量、檢測平臺以及檢測成本達到最優化的設計；檢測的基因種類也應需隨著臨床診療的研究進展定期更新；最后，選擇檢測區域時，對于引物/探針覆蓋不到的重要區域，或者大片段插入/缺失、堿基不平衡（連續堿基、高GC片段）等NGS效果差的基因片段，例如，FLT3-ITD、CEBPA、NPM1等基因，需要通過PCR和Sanger測序等方法補充檢測，避免出現假陰性。

2.實驗流程中有哪些注意事項？（1）骨髓、外周血或組織樣本均可檢測，但是脫鈣樣品不能用于NGS檢測，已染色的組織標本不推薦進行NGS檢測。無論是何種樣本，首先都要確保樣本中含有足夠數量的腫瘤細胞。一般情況下，建議NGS檢測的組織樣本中腫瘤細胞含量達到20%以上[8]，否則應富集腫瘤細胞或增加測序深度，避免假陰性結果。此外，為了準確區分胚系突變與體細胞突變，建議同時送檢患者正常組織作為胚系突變對照。（2）DNA提取后，要對DNA進行濃度、純度和完整性的評估，尤其是石蠟組織樣本；同時設立明確的合格樣本標準，通常A260/280 應介于1.6-2.2，A260/230 應介于1.6-3.0，DNA濃度建議不少于20ng/ul。（3）文庫制備時，多標本同時測序應明確不同的檢測標本和分子標簽的對應關系。各實驗室應依據測序平臺及測序策略建立最低的合格文庫量，文庫濃度過高或過低會導致測序數據量減少文庫片段。文庫片段小會導致測序數據量少，片段大導致測序質量下降及拼接錯誤率增加。

3.如何進行生物信息學分析？對NGS產生的原始數據需要經過質控分析、數據過濾、序列比對、突變位點的識別和注釋以及突變位點的篩選一系列生物信息分析。《共識》對每個步驟的生物信息處理進行了詳盡的介紹，并列舉了分析過程中常用到的軟件和參考數據庫，實驗室需要提前選擇合適的軟件，并設定好相應的分析參數和質控指標，保證數據分析的準確性。突變位點篩選環節雖然大部分實驗室已實現自動化，但必要時還應進行人工核對，盡可能排除假陽性和假陰性位點。篩選時主要考慮變異位點的測序深度、reads數、變異等位基因頻率、堿基比對質量值等指標，同時參考變異位置、變異類型、功能預測數據庫、人群數據庫及疾病數據庫等。

此外，為了準確識別腫瘤的體細胞突變，建議同時檢測患者的正常組織（口腔黏膜或毛囊等）作為胚系突變對照。若無法實現，實驗室可參考變異等位基因頻率、dbSNP、人群數據庫、實驗室自建數據庫等，盡可能區分體細胞突變和胚系突變。

4.結果報告和解讀：如何把經過生物信息學分析后的檢測數據完整準確地轉換為醫學信息，是NGS臨床應用面臨的挑戰之一。《共識》從報告的基本信息、突變位點的描述和分級報告，以及如何進行報告解讀等方面進行了細致闡述。

實驗室應盡可能的將檢測結果以全面、客觀、簡明、易懂的方式呈現給臨床醫生及患者，為此應注意：1）報告內容的解讀需由具備臨床醫學（尤其是血液學）及分子遺傳學專業背景的人員共同參與，以滿足臨床應用的特殊要求；2）在對突變位點詳細解讀之前，建議根據患者情況進行總結性的說明，以方便臨床醫生從報告中迅速獲取關鍵信息；對于多次送檢的患者，尤其需要注意結合以往檢測結果和臨床信息進行綜合分析；3）推薦根據突變位點的臨床意義進行分級報告，分為具有明確臨床意義的突變、具有潛在臨床意義的突變、臨床意義未明的突變。新發現的良性或可能良性變異不建議列在報告中。突變位點的描述信息應盡可能全面，如物理坐標、變異頻率、測序深度等；4）報告中應描述突變位點在臨床診斷、預后評估和治療中的意義，并提供數據庫或參考文獻等支持依據，同時應特別注意數據庫及參考文獻的適用性，避免檢測結果的過度解讀；5）陰性結果不完全代表不存在突變，應注意排除由于靈敏度或檢測區域局限性等技術原因所導致的假陰性；6）隨著研究的進展，某些基因的臨床意義等信息可能會更新，如有特殊需求時可考慮補充報告內容[9]。

三

如何做好NGS？

完善的質量控制體系是保證檢測結果及時準確的前提。總體來講，NGS的質量控制和其它分子生物學檢測相似。首先應滿足《分子病理診斷實驗室建設指南（試行）》、《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》等分子生物學檢測行業的通用要求。同時鑒于NGS方法的復雜性，分析前、分析中、分析后的各個環節都應設立嚴格的專業化的室內質控標準，并對有可能影響到檢測結果準確性的各個因素進行評估和規定，包括人員、儀器、試劑、環境、檢測方法等。同時還應定期參加室間質評項目或實驗室間比對。

四

結語

NGS自身的優勢決定了其廣泛的應用前景，但同時技術的復雜性也決定了應用中會面臨各類挑戰。相信隨著科學技術的進一步發展，相關管理監督機制的日臻完善，NGS的臨床實踐將會越來越規范化，也將在疾病的臨床診療中發揮越來越重要的作用。

參考文獻略

注：本文來源于《臨床實驗室》2020年第5期“腫瘤及伴隨診斷”專題